實驗條件的選擇

在 ELISA 中，選擇各種實驗條件很重要，包括：

(1)固相載體的選擇：許多物質都可以用作固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、纖維素等?？梢允强装?、試管、珠子等形式，常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。無論是何種載體，使用前都可以進行篩選：包被等量的抗原，在相同的實驗條件下進行反應。

(2)包被抗體(或抗原)的選擇：當抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度較好，一般要求pH在9.0～9.6之間在吸附過程中。吸附溫度、時間和蛋白質的量也有一定的影響，一般4℃18～24小時。蛋白質包被的最佳濃度需要進行滴定：即在包被不同的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）后，在其他測試條件相同的情況下觀察陽性樣品的OD值.選擇 OD 值最高、蛋白質含量最少的濃度。對于大多數(shù)蛋白質，通常為 1-10 μg/ml。

（3）酶標抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法滴定初始效價（見酶標抗體部分）。然后固定其他條件或采用“方陣法"（包被材料、待測樣品對照品和酶標抗體處于不同稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)中準確滴定工作濃度。

(4)酶底物和氫供體的選擇：氫供體的選擇要求便宜、安全、顯色反應明顯，但本身是無色的。一些供氫體（如OPD等）具有潛在的致癌作用，應予以保護。有條件的應選用非致癌、高靈敏度的供氫體，如TMB、ABTS等，都是比較滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿停止。一般底物作用時間為10-30分鐘。底物溶液必須新鮮配制，特別是在使用前應立即加入 H2O2。

主要設備

試劑

(1) 包被緩沖液（pH9.60.05M 碳酸鹽緩沖液）：

Na2CO3 1.59g

碳酸氫鈉 2.93g

加入蒸餾水至 1000ml

（2）洗滌緩沖液（PH7.4PBS）：0.15M

KH2PO4 0.2g

Na2HPO4 12H2O 2.9g

氯化鈉 8.0g

0.2g

Tween-20 0.05% 0.5ml

加入蒸餾水至 1000ml

(3) 稀釋劑：

牛血清白蛋白 (BSA) 0.1 克

加入洗滌緩沖液至 100ml

或用山羊血清、兔血清等血清和洗滌液補足5-10%。

(4) 終止液（3M H2SO4）：

滴加蒸餾水178.3ml、濃硫酸（98%）21.7ml。

(5)底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸)：

0.2MNa2HPO4 (28.4g/L) 25.7ml

0.1M檸檬酸（19.2g/L）24.3ml

加入 50ml 蒸餾水。

(6)TMB(四甲基聯(lián)苯胺)溶液：

TMB（10mg/5ml 無水乙醇）0.5ml

底物緩沖液 (PH5.5) 10ml

0.75%H2O2 32μl

(7) ABTS使用液：

ABTS 0.5mg

底物緩沖液 (PH5.5) 1ml

3%H2O2 2μl

(8)抗原、抗體和酶標抗體。

(9)正常人血清和陽性對照血清。

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